BluePippin — система и , позволяет разделять и выделять фрагменты НК, размером 90-50000 п.н., а так же белки массой 18-200 кДа.
Максимальная нагрузка ДНК на дорожку:10 мкг фрагментированной геномной ДНК;2 мкг ДНК определённого размера;минимальная нагрузка ДНК:от нескольких нг фрагментированной геномной ДНК;50 нг ДНК определённого размера;максимальная нагрузка белка — 3,5 мкг;максимально возможное количество получаемого образца на выходе — 40 мкл;длина волны возбуждения, нм — 470;длина детекции, нм — 525;источник света — светодиоды LED;напряжение при электрофорезе, В — 25, 100 и 150 (постоянный ток), или 100 в режиме пульс-электрофореза;ток (на каждую дорожку), мА — 2 или 3;точность и воспроизводимость выделения, % — 5-10, в зависимости от геля;точность (режим постоянного тока), % - >93;воспроизводимость (режим постоянного тока), % - >92;минимальное распределение по размерам, % - 8;выход образца, % — 50-80;габариты, ШхГхВ, см — 28х53х18;вес, кг — 7.Области применения:
приготовление библиотек при проведении , , (); , , , (); , ();подготовка образов для парноконцевого , ChIP-;улучшение библиотек при проведении с помощью систем и (); и белков.Принцип работы: в системе используются готовые картриджи на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем разной процентной концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины фрагмента образца. В конце каждого капилляра имеется Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения используется Tris-TAPS (или Трис-ТАПС) буфер, для белков — SDS-буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции .
4 режима программирования:
Tight (узкий) — сбор коротких фрагментов образца, выбирается в основном для работы с молекулами небольших размеров.Range (диапазон) — пользователь может сам выбрать диапазон размера фракций который ему необходим. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.Time (время) — коллекционирование образцов происходит в зависимости от заданного времени. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.Peak (пик) — сбор пиков (нескольких фрагментов разного размера).3 стратегии детектирования фракций:
Для ДНК малых размеров (90 п.н. −1,5 тыс.п.н.):Стратегия без окрашивания с внутренними флуоресцентно-мечеными маркерами. В качестве внутренних стандартов используются флуоресцентно-меченые , определенной молекулярной массы. Добавляются в лунку совместно с исследуемым образцом. Одновременно возможен анализ 5 образцов.Для ДНК больших размеров (> 2 тыс. п.н.):Стратегия без окрашивания с внешним флуоресцентно-меченым маркером. В качестве внешнего стандарта используется флуоресцентно-меченый определённой молекулярной массы, добавляется в отдельную лунку. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.Для выделения ДНК с дорожки (band capture) (> 2 тыс. п.н.):Окрашивание образцов флуоресцентным красителем Midori Green. Образцы окрашиваются флуоресцентным красителем Midori Green. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.Преимущества метода:
Время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов. Благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат .Каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации.Отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для спаренных концов.Отбор образцов из пробоотборной камеры производится вручную с помощью стандартного дозатора.Схема работы:
Пробоподготовка:Подготовка материала, если используются внутренние стандарты: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл флуоресцентно — меченного маркера.Подготовка материала, если используется внешний стандарт: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл загрузочного раствора. 40 мкл готового стандарта помещается в отдельную дорожку.В случае с красителем Midori Green, 40 мкл красителя помещается в каждую из пяти + буферную камеру и при включении тока будет двигаться на встречу образцам.Эксперимент:Выбираем картридж в соответствии со стратегией, с помощью которой будет производиться детектирование НК;помещаем картридж в прибор и выбираем её в ПО из списка предложенных программой (ПО само установит все необходимые параметры для проведения электрофореза под выбранный картридж);По истечении времени, заданного программой, образец аккуратно собираем из коллектора фракций .Информация о свежих статьях:
1. Nature Methods. Assembly and diploid architecture of an individual human genome via single-molecule technologies (июнь, 2015); Authors: Matthew Pendleton, Robert Sebra, Andy Wing Chun Pang, Ajay Ummat et al.2. BioTechniques. Optimization and cost-saving in tagmentation-based mate-pair library preparation and sequencing. (май, 2015) DOI:10.1038/nmeth.3454; Authors: Kaori Tatsumi, Osamu Nishimura, Kazu Itomi, Chiharu Tanegashima, and Shigehiro Kuraku.
Видео: Системы препаративного электрофореза BluePippin и Pippin Prep
Для проведения пульс-электрофореза применяется специальный источник питания Pippin Pulse.
