Электрофорез горизонтальный

BluePippin — система и , позволяет разделять и выделять фрагменты НК, размером 90-50000 п.н., а так же белки массой 18-200 кДа.

Максимальная нагрузка ДНК на дорожку:10 мкг фрагментированной геномной ДНК;2 мкг ДНК определённого размера;минимальная нагрузка ДНК:от нескольких нг фрагментированной геномной ДНК;50 нг ДНК определённого размера;максимальная нагрузка белка — 3,5 мкг;максимально возможное количество получаемого образца на выходе — 40 мкл;длина волны возбуждения, нм — 470;длина детекции, нм — 525;источник света — светодиоды LED;напряжение при электрофорезе, В — 25, 100 и 150 (постоянный ток), или 100 в режиме пульс-электрофореза;ток (на каждую дорожку), мА — 2 или 3;точность и воспроизводимость выделения, % — 5-10, в зависимости от геля;точность (режим постоянного тока), % - >93;воспроизводимость (режим постоянного тока), % - >92;минимальное распределение по размерам, % - 8;выход образца, % — 50-80;габариты, ШхГхВ, см — 28х53х18;вес, кг — 7.

Области применения:

приготовление библиотек при проведении , , (); , , , (); , ();подготовка образов для парноконцевого , ChIP-;улучшение библиотек при проведении с помощью систем и (); и белков.

Принцип работы: в системе используются готовые картриджи на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем разной процентной концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины фрагмента образца. В конце каждого капилляра имеется Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения используется Tris-TAPS (или Трис-ТАПС) буфер, для белков — SDS-буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции .

4 режима программирования:

Tight (узкий) — сбор коротких фрагментов образца, выбирается в основном для работы с молекулами небольших размеров.Range (диапазон) — пользователь может сам выбрать диапазон размера фракций который ему необходим. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.Time (время) — коллекционирование образцов происходит в зависимости от заданного времени. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.Peak (пик) — сбор пиков (нескольких фрагментов разного размера).

3 стратегии детектирования фракций:

Для ДНК малых размеров (90 п.н. −1,5 тыс.п.н.):Стратегия без окрашивания с внутренними флуоресцентно-мечеными маркерами. В качестве внутренних стандартов используются флуоресцентно-меченые , определенной молекулярной массы. Добавляются в лунку совместно с исследуемым образцом. Одновременно возможен анализ 5 образцов.Для ДНК больших размеров (> 2 тыс. п.н.):Стратегия без окрашивания с внешним флуоресцентно-меченым маркером. В качестве внешнего стандарта используется флуоресцентно-меченый определённой молекулярной массы, добавляется в отдельную лунку. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.Для выделения ДНК с дорожки (band capture) (> 2 тыс. п.н.):Окрашивание образцов флуоресцентным красителем Midori Green. Образцы окрашиваются флуоресцентным красителем Midori Green. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.

Преимущества метода:

Время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов. Благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат .Каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации.Отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для спаренных концов.Отбор образцов из пробоотборной камеры производится вручную с помощью стандартного дозатора.

Схема работы:

Пробоподготовка:Подготовка материала, если используются внутренние стандарты: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл флуоресцентно — меченного маркера.Подготовка материала, если используется внешний стандарт: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл загрузочного раствора. 40 мкл готового стандарта помещается в отдельную дорожку.В случае с красителем Midori Green, 40 мкл красителя помещается в каждую из пяти + буферную камеру и при включении тока будет двигаться на встречу образцам.Эксперимент:Выбираем картридж в соответствии со стратегией, с помощью которой будет производиться детектирование НК;помещаем картридж в прибор и выбираем её в ПО из списка предложенных программой (ПО само установит все необходимые параметры для проведения электрофореза под выбранный картридж);По истечении времени, заданного программой, образец аккуратно собираем из коллектора фракций .

Информация о свежих статьях:

1. Nature Methods. Assembly and diploid architecture of an individual human genome via single-molecule technologies (июнь, 2015); Authors: Matthew Pendleton, Robert Sebra, Andy Wing Chun Pang, Ajay Ummat et al.2. BioTechniques. Optimization and cost-saving in tagmentation-based mate-pair library preparation and sequencing. (май, 2015) DOI:10.1038/nmeth.3454; Authors: Kaori Tatsumi, Osamu Nishimura, Kazu Itomi, Chiharu Tanegashima, and Shigehiro Kuraku.

Видео: Системы препаративного электрофореза BluePippin и Pippin Prep

Для проведения пульс-электрофореза применяется специальный источник питания Pippin Pulse.

Система препаративного электрофореза для разделения и выделения только фрагментов ДНК размером от 50 до 8000 п.о.; детекция фракций осуществляется без использования УФ, что гарантирует отсутствие повреждения фрагментов.

Технические характеристики:

напряжение при электрофорезе, В — 100 или 150;ток (на каждую дорожку), мА — 2 или 3;длина волны возбуждения, нм — 535;длина детекции, нм — 640;максимальное количество ДНК:— 10 мкг фрагментированной геномной ДНК;— 4 мкг ДНК определённого размера;точность и воспроизводимость выделения, % — 5-10, в зависимости от геля;выход образца, % — 50-80;габариты, ШхГхВ, см — 18×28×53;вес, кг — 7.

Принцип работы:

В системе используются готовые кассеты на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем. В конце каждого капилляра есть Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки.

Преимущества метода:

за один сеанс система может работать параллельно с 4 образцами + 1 внешний стандарт или с 5 образцами при использовании внутреннего стандарта; время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов;благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат секвенирования;каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации;отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для секвенирования спаренных концов.

Области применения:

приготовление библиотек при проведении NGS;подготовка образцов для парноконцевого секвенирования, ChIP-секвенирования;улучшение библиотек при проведении эмульсионной ПЦР;выделение белков и НК.

Характеристики картриджей:

0,75% агарозные картриджи BluePippin0,75% агарозные картриджи PippinPrep1,5% агарозные картриджи2% агарозные картриджи3% агарозные картриджиКоличество образцов44444Диапазон размеров НК1000-50000 п.о.2000-8000 п.о.180-1500 п.о.100 — 600 п.о.50 — 200 п.о.Точность детекции, %

± 5 (с интеркалирующим красителем)

± 10 (без красителя)

± 5 (с интеркалирующим красителем)

± 10 (без красителя)

± 5 (с интеркалирующим красителем)

± 10 (без красителя)

± 5 (с интеркалирующим красителем)

± 10 (без красителя)± 5Видео: Системы препаративного электрофореза BluePippin и Pippin Prep

PippinHT — система препаративного электрофореза и пульс-электрофореза, позволяет разделять и выделять фрагменты нуклеиновых кислот и белков. Для разделения используются одна или две готовые кассеты по 12 ячеек, с различной концентрацией агарозы, что позволяет разделить один образец на несколько фракций, в каждой их которых содержатся молекулы нуклеиновых кислот или белков определённого размера.

Технические характеристики:

Максимальная загрузка образца в ячейку – 1,5 мкг; время анализа – 25-50 мин в зависимости от размера молекул в образце; диапазон размеров разделяемых молекул ДНК, п.н. – 90-2000:

o кассеты с 3% агарозой, п.н. – 90-250;

o кассеты с 2% агарозой, п.н. – 100-600.;

o кассеты с 1,5% агарозой, п.н. – 300-1500;

o кассеты с 0,75% агарозой, п.н. – более 1500;

воспроизводимость, % – более 90; длина волны возбуждения, нм — 470; длина волны детекции, нм — 525; источник тока: 100-240 В, 2,5 А, 50 Гц; габариты без / в упаковке, см - 18 x 13 x 17 / 46 x 33 x 64 см; вес, кг – 9.

Принцип работы:

Используются две готовые кассеты на 12 изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем определённой концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины выделяемого из образца фрагмента. В конце каждого капилляра имеется Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения электрофореза нуклеиновых кислот используется Трис-Taps буфер, для белков – SDS-буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции ДНК-маркера.