В клетке могут встречаться редкие мутации, например, лишь в одной из нескольких сотен клеточных митохондриальных ДНК. В общей смеси при обычном ПЦР при таком сильном разведении эти мутации невозможно обнаружить. Похожая картина нередко наблюдается в отношении минорных опухолевых мутациях. Цифровой капельный ПЦР (Droplet Digital PCR) — усовершенствованный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), при котором реакционная смесь после добавления ДНК распыляется на множество мельчайших капель, попадающих на лунки чипа. Чип может содержать несколько десятков тысяч ячеек, на которых в каплях протекает ПЦР. При этом возможна визуализация результата реакции с каждой ячейки. По завершению реакции данный чип может быть использован для проведения или клонирования с каждой капли.
Инновационная система QX200 Droplet AutoDG Digital PCR предназначена для проведения цифровой капельной ПЦР третьего поколения, позволяющей добиться высочайшей точности и достоверности результатов. Система включает в себя автоматический Droplet Generator (генератор микродисперсионных капель из кДНК или РНК-содержащих образцов) со встроенным цветным монитором, QX200 Droplet Reader (позволяет осуществлять сверхчувствительный и точный автоматический анализ продуктов амплификации) и Automated Droplet Generator, который автоматической загрузки образцов и дальнейшее его пипетирование на 96 луночный планшет в генераторе капель. Аппарат AutoDG имеет свой собственный кожух и фильтр НЕРА, что ведет к снижению вероятности загрязнения, поэтому система может быть использована на стандартном лабораторном столе, без необходимости применения бокса для ПЦР или чистой комнаты.
Преимущества цифрового капельного ПЦР по сравнению с RТ ПЦР:
исключительная чувствительность;исключительная точность;отсутствие калибровочных кривых;прямое обнаружение редкого варианта мишени в сложном окружении;отсутствие эффекта первых циклов ПЦР;большая производительность;ручная работа предельно упрощена и сведена к минимуму;генерация капель для 96 образцов за 45 минут;HEPA-фильтры для снижения риска контаминации;цветной сенсорный экран с удобным программным обеспечением.Применения системы цифровой ПЦР :
Количественная оценка биомаркеров рака. Мутациям, ассоциированным с онкологией, часто удаётся избежать детектирования из-за их низкой концентрации по сравнению с фоновой ДНК дикого типа в том же образце. За счёт высокой чувствительности система позволяет детектировать и количественно оценивать мутации в концентрациях от 0,0001% (!) - одна на сто тысяч. Обнаружение и оценка возбудителей заболеваний. Точная количественная оценка вирусной нагрузки крайне важна для определения состояния заболевания, разработки, утверждения и оценки эффективности терапии. обладает чувствительностью достаточной для обнаружения сверхмалых количеств вирусного генетического материала и в том числе и в сложных смесяхОпределение количества копий гена (CNV). Вариации числа копий гена (CNV) является значимым источником полиморфизма в геноме человека. CNV ассоциируется с раком, неврологическими и аутоиммунными заболеваниями, а также с побочными эффектами при воздействии лекарственных средств. позволяет определить CNV с точностью соотношения 1.2х (!), например, пять против шести.Валидация и количественная оценка библиотек NGS. С помощью технологии цифровой ПЦР можно качественно и количественно оценить библиотеку, что позволяет наиболее эффективно использовать секвенаторы.Анализ экспрессии генов. Капельная цифровая ПЦР позволяет количественно определить уровень экспрессии гена. Благодаря высокой точности и чувствительности метода возможна оценка минимального 10% (!) изменения экспрессии, в том числе и при низких концентрациях.Тестирование продуктов на наличие ГМО. С точностью до тысячных долей процента позволяет оценить количество генетически модифицированных ингредиентов в продуктах питания, сырье кормах.с использованием технологии капельной ПЦР
о системе и её применении
о цифровой ПЦР c использованием системы и ПО ddPCR
Этапы проведения эксперимента при использовании метода цифровой ПЦР.
Капельная цифровая ПЦР осуществляется в четыре последовательных этапа:
Подготовка реакционной смеси. Подготавливают 20 мкл реакционной ПЦР смеси для каждого образца, затем смесь помещают в пластиковый картридж QX200 droplet генератора.Генерация капель. В соответствующие каналы картриджа заливается специальное минеральное масло, и наполненный картридж устанавливают в QX200 droplet генератор, где образцы и масло соединяются между собой по микро каналам внутри картриджа для получения эмульсии — около 20 000 монодисперсных капель для каждого из 8 подготовленных образцов. Объем каждой капли 1 нл.Полимеразная цепная реакция. Эмульсионные образцы переносятся на стандартную 96-луночную плашку для ПЦР и амплифицируются с помощью стандартного термоциклера, например C1000 touch.Считывание и анализ результатов. После завершения ПЦР плашка загружается в QX200 droplet ридер, который обеспечивает анализ флуоресцентного сигнала капель, детектируя каждую каплю по очереди и определяя, какие капли содержат мишень, а какие нет. Анализ результатов осуществляется с помощью программного обеспечения ddPCR.Сопутствующие разделы:
