Экстра-микс RT-qPCR предназначен для проведения обратной транскрипции и количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентных зондов одношаговым методом. Кроме собственно экстра-микса, в состав набора входят 2-кратный буфер RT-qPCR и вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). Буфер оптимизирован для протекания как обратной транскрипции, так и ПЦР и содержит все необходимые компоненты (за исключением РНК-матрицы и праймеров). Хранение буфера при комнатной температуре в течение 2 дней не снижает эффективность реакции. Компоненты набора не содержат красителей, что делает его универсальным.Экстра-микс RT-qPCR представляет собой смесь обратной транскриптазы MMLV-RH и HS-Taq ДНК-полимеразы с "горячим" стартом в оптимальном соотношении для протекания обеих реакций.MMLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от обратной транскриптазы MMLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. MMLV–RH проявляет оптимальную активность при +42°С (активна до +50°С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 10 т.н. и включать модифицированные основания.HS-Taq ДНК-полимераза представляет собой рекомбинантную Taq ДНК-полимеразу, инактивированную специфическими моноклональными антителами. HS-Taq ДНК-полимераза неактивна при температуре ниже +70оС. Для её активации необходим прогрев реакционной смеси при +95°С в течение 5 мин. Рекомбинантная HS-Taq ДНК-полимераза обладает 5´-3´ ДНК-зависимой полимеразной активностью и 5’-3’ экзонуклеазной активностью нативной Taq ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus. Скорость продвижения Taq ДНК-полимеразы зависит от сложности ДНК-матрицы и составляет примерно 1 т.п.н./мин. Рекомбинантная HS-Taq ДНК-полимераза идеально подходит для стандартной ПЦР с матрицы до 5 т.п.н.; обладает способностью присоединять аденин к 3’-концу синтезируемой цепи, поэтому продукты ПЦР могут использоваться для ТА-клонирования.Состав набора Кат. № Кол-во реакций по 50 мкл Экстра-микс RT-qPCR Буфер RT-qPCR (2x) ДМСО Вода, обработанная ДЭПК1969.00404080 мкл2 х 0,5 мл0,5 мл2 х 0,5 мл1969.02002002 х 200 мкл4 х 1,25 мл0,5 мл3 х 1,8 млСостав Экстра-микса RT-qPCR: 50 мM Трис-НCl, рН 8.0 (при +25 °С);100 мM NaCl;MMLV-RH обратная транскриптаза;HS-Taq ДНК-полимераза;1 мМ ЭДТА;5 мМ дитиотреитол;50% (v/v) глицерин;0,1% (v/v) NP-40.Состав буфера RT-qPCR (2х): 100 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25 °С);150 мM КCl;0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;10 мМ MgCl2;8 мМ дитиотреитол;стабилизаторы и усилители активности ферментов.Преимущества использования экстра-микса:Высокая специфичность.Высокая чувствительность.Простота и удобство в использовании.Низкая ошибка пипетирования и вероятности кросс-контаминации.Стандартизация условий постановки однотипных реакций (снижается погрешность при смешивании компонентов ПЦР в разных экспериментах).Возможность ТА-клонирования ПЦР-продуктов. Область применения: Одношаговая стандартная ОТ-ПЦР.Количественный анализ РНК, в том числе анализ экспрессии генов.Не рекомендуется использовать для ампликонов длиной свыше 5 тыс. п.н. Срок хранения и транспортировка: 9 месяцев при -20 °С; не более 30 циклов замораживания-размораживания экстра-микса RT-qPCR.
